肠炎沙门菌溶血素共调节蛋白hcp基因及其致病性相关研究

【摘要】沙门菌病(Salmonellosis)是重要的人畜共患病,严重危害人类健康和畜禽养殖业。该病原沙门菌属超过2500种已知的血清型,其致病性和宿主特异性不一,感染程度可以从亚临床定殖感染到严重全身系统性疾病。其中,肠炎沙门菌(SalmonellaEnteritidis)是一种侵袭性强、泛嗜性宿主的人畜共患病原菌,宿主包括人类和各种动物。该菌常常产生一个亚临床感染并持续排菌,引起家禽发病死亡,并造成严重的经济损失；人类消费了受污染的禽类产品导致急性胃肠炎。据统计,人类食物中毒事件中60%-80%是由禽沙门菌引起的,其中主要病原为肠炎沙门菌。细菌和宿主之间的相互作用受通信/信号相互影响,作为接触依赖型致病菌,沙门菌分泌系统影响宿主应答反应,其分泌装置分泌的蛋白质和毒素,是对靶细胞产生毒性和其胞内生存的关键。VI型分泌系统(TypeVIsecretionsystem,T6SS)存在于大多数革兰氏阴性细菌,包括植物和动物病原体,是细菌体内蛋白质转运的一个新近描述的分泌机制,被普遍认为是革兰氏阴性菌潜在的毒力决定因子。T6SS往往位于病原菌的毒力岛上,如肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichiacoli)pheU、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)HSI和鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)SCI等。生物信息学和比较基因组学分析表明沙门菌属编码五种T6SS基因簇,高度保守,差异分布在各种血清型的不同毒力岛上(SPI-6,SPI-19,SPI-20,SPI-21和SPI-22),并存在不同的系统发育史,是不同沙门菌T6SS基因簇在不同环境下进化的结果。SPI-19T6SS广泛的分布在五种致病性沙门菌血清型中,都柏林(Dublin)、韦太夫雷登(Weltervreden)、阿贡纳(Agona)和鸡沙门(Gallinarum)都编码一个约44Kb基因组结构高度保守的SPI-19,肠炎沙门菌SPI-19仅编码16个ORFs,包含有3个T6SS核心组件：SEN1002(Hcp样蛋白质),SEN1003(ImpA同系物)和SEN1004(一个被截短的IcmF),其中Hcp蛋白为溶血素调节蛋白,对应于鸡沙门菌编码大部分的T6SS功能hcp1操纵子。近期研究表明鸡沙门菌是肠炎沙门菌的直系后代,已经在鸟类获得宿主适应,从鸡沙门菌中将SPI-19水平转移到肠炎沙门菌中增强了细菌在感染鸡的回肠、肝、脾的初始定殖能力,SPI-19T6SS结构的差异被认为与致病菌和宿主巨噬细胞的交互作用有关,因此,hcp可能在肠炎沙门菌的毒力形成过程中扮演了重要的角色,深入研究肠炎沙门菌SPI-19编码的hcp毒力相关功能,为肠炎沙门菌致病机理的研究及肠炎沙门菌的防控奠定了基础。根据肠炎沙门菌标准株P125109中SPI-19编码的hcp序列,本试验利用Red同源重组系统对2株肠炎沙门菌(国内标准株CMCC(B)50336和标准株SD-2)SPI-19的hcp基因进行缺失敲除,成功构建了50336△hcp和SD-2△hcp基因缺失株,并同时构建了回补株50336△hcp/phcp和SD-2△hcp/phcp。分析比较缺失株与野生株对人结肠上皮细胞系Caco-2黏附和侵袭能力,以及在鸡巨噬细胞HD11的存活能力。结果显示：缺失hcp基因后,肠炎沙门菌50336△hcp对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降39.1%和47.9%；SD-2Ahcp对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降46.5%和58.9%。吞噬作用2h后,50336Ahcp和SD-2△hcp与野生株相比在HD11的存活量分别下降了35.7%和37.2%,统计学差异显著。回补hcp后能在一定程度上提高细菌的黏附、侵袭和抗吞噬的作用。通过RealTime-PCR实验分析,与野生株相比,hcp基因缺失后fliC、sefA、ompA、ompC这四个重要粘附因子编码基因的表达量显著下降,编码鞭毛主要亚单位fliC的表达量是野生株的28.7%(50336株)和37.1%(SD-2株);编码SEF14菌毛主要亚单位sefA的表达量是野生株的14.7%(50336株)和18.8%(SD-2株)；编码主要外膜孔道蛋白ompA是野生株的37%(50336株)和47.5%(SD-2株)；编码主要外膜孔道蛋白ompC是野生株的38%(50336株)和29.7%(SD-2株)。试验初步表明,肠炎沙门菌SPI-19编码的hcp基因对肠炎沙门菌的毒力具有增强作用,hcp的存在与fliC、sefA、ompA、ompC这四个重要粘附因子编码基因的表达密切相关。细菌生物被膜的形成主要受细菌AI-2群体感应和菌体表面黏附素调控和影响,肠炎沙门菌SPI-19编码的hcp基因缺失能下调SEF14菌毛和鞭毛的表达。为了探究hcp基因对肠炎沙门菌生物被膜形成能力的影响和潜在机制,通过结晶紫染色法定量肠炎沙门菌50336和SD-2的hcp突变缺失株及相应回补株的生物被膜形成能力,并与sefA和fliC缺失突变株的生物被膜形成能力对比发现,50336△hcp和SD-2△hcp与相应亲本株相比生物被膜形成能力分别降低67%和69%。而50336△fliC与亲本株相比生物被膜形成能力降低49%,SD-2△fliC与亲本株相比生物被膜形成能力降低54%,sefA缺失对生物被膜形成无显著影响。此外,通过对野生株及hcp缺失株AI-2分子活性检测发现,AI-2群体感应系统并未受到显著影响。上述结果表明hcp基因缺失显著影响肠炎沙门菌生物被膜的形成。利用PCR方法扩增2株肠炎沙门菌参考株50336和SD-2SPI-19内的hcp基因,将其序列鉴定后克隆入原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET28a-hcp,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导重组细菌高效表达；表达的产物以包涵体的形式存在,在变性的条件下用镍亲和柱纯化得到重组蛋白,以每只50μg蛋白剂量免疫小鼠3次,间接ELISA测定抗体效价；用Westernblot验证免疫血清的反应特异性。测序结果显示,获得的两个参考株hcp基因的核苷酸序列与已发表序列的同源性为100%。SDS-PAGE显示预期的20kDa重组蛋白rHcp,表达产物主要以包涵体形式存在,通过镍亲和层析和尿素变性/复性获得了可溶性的纯化蛋白：免疫小鼠第五周抗体效价达1：8000,且能特异性检测出SPI-19hcp+肠炎沙门菌和鸡沙门菌中表达的Hcp蛋白。上述结果表明,制备的外源性重组蛋白rHcp具有较好的免疫原性和反应原性。首次证明了肠炎沙门菌和鸡沙门菌中Hcp蛋白均为菌体结构蛋白,而不分泌到菌体胞外,为下一步深入探究Hcp蛋白在参与肠炎沙门菌和鸡沙门菌毒力的具体机制提供新的信息。为进一步探究SPI-19编码的hcp在肠炎沙门菌体内致病过程中的作用,将肠炎沙门菌SPI-19编码的hcp基因缺失株50336△hcp和SD-2△hcp分别皮下接种6周龄BALB/c小鼠和1日龄清远麻鸡,通过半数致死量的测定来比较它们与野生株50336和SD-2以及相应回补株50336Ahcp/phcp和SD-2△hcp/phcp的致病性差异。结果显示,缺失hcp基因后,肠炎沙门菌50336△hcp和SD-2△hcp对小鼠的半数致死量分别为79.43cfu和125.89cfu；对雏鸡的半数致死量分别为89.13×107cfu和158.49×107cfu；回补hcp基因后,即相应回补株50336△hcp/phcp和SD-2△hcp/phcp对小鼠的半数致死量分别为50.12cfu和19.95cfu；对雏鸡的半数致死量分别为56.23×107cfu和39.81×107cfu；而亲本株50336和SD-2对BALB/c小鼠的半数致死量分别为19.95cfu和7.94cfu,对雏鸡的半数致死量分别为25.12×107cfu和14.13×107cfu。50336Ahcp和SD-2Ahcp的107个CEF,感染组10日龄平均体重增重分别为47.35g和49.25g,野生株组为42.31g和41.42g,回补株组为45.82g和46.09g。试验表明相应回补株50336Ahcp/phcp和SD-2Ahcp/phcp在BALB/c小鼠和1日龄清远麻鸡的致病力以及体重影响指标上与亲本株50336和SD-2基本接近,肠炎沙门菌SPI-19编码的hcp基因对肠炎沙门菌的致病性具有显著的增强作用。总之,上述试验结果证明了hcp基因是肠炎沙门菌菌体的重要组成部分,在其fliC、sefA、ompA、ompC这四个重要粘附因子编码基因的表达、体外细胞系有效的黏附定殖、抗吞噬作用及生物被膜形成中扮演着重要的角色,并进一步通过动物感染试验揭示其在肠炎沙门菌致病过程中的作用。试验尝试通过构建的突变株探索中国地方品种鸡与肠炎沙门菌的易感性之间的关联,为解决肠炎沙门菌的食品安全卫生问题和隐性带菌感染等难题寻找新的线索。上述研究结果带来启示：hcp是否可以也作为一种黏附素参与到肠炎沙门菌和鸡沙门菌对宿主细胞的定植过程中,从而进一步拓宽沙门菌黏附素的概念,为今后深入研究Hcp蛋白在肠炎沙门菌和鸡沙门菌的毒力形成中所扮演的角色提供必需的基础材料,更多重要的信息还有待进一步研究、发掘。
【作者】姚丰华；
【导师】朱国强；
【作者基本信息】扬州大学，基础兽医学，2014，博士
【关键词】肠炎沙门菌；SPI-19；hcp基因；缺失；功能；

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